Nowe metody oznaczania DAPA

Opracowano metody oznaczania kwasu 2,6-diaminopimelinowego (DAPA) przy użyciu zestawu HPLC (Waters) i kolumny z odwróconą fazą (Nova-Pak C18) poprzez elucję gradientową oraz detekcję UV przy 340 nm lub fluorescencyjną (wzbudzenie 229 nm, detekcja 470 nm). Po hydrolizie próbek DAPA przeprowadzano w pochodne przy użyciu o-ftaldialdehydu (OPA) w obecności 2-merkaptoetanolu (metoda 1) lub OPA w obecności etanotiolu (metoda 2) z ewentualnym usunięciem nadmiaru innych aminokwasów (metoda 3). Metodą 1 można rozdzielić poszczególe izomery DAPA. Na podstawie otrzymanych wyników można wnioskować, że metody 1 i 2 mogą być wystarczająco czułe i selektywne do oznaczania DAPA w bakteriach przy użyciu detekcji UV. Natomiast zastosowanie metody 3 z detekcją fluorescencyjną pozwala uzyskać zadowalające wyniki nawet przy bardzo niskich stężeniach DAPA.

The methods for 2,6-diaminopimelic acid (DAPA) determination were elaborated using HPLC (Waters) set and reversed-phase column (Nova-Pak C18) with gradient elution and UV detection at 340 nm or fluorescence detection (229 nm excitation and 470 nm detection). Samples were hydrolysed and DAPA was derivatised with o-phtaldialdehyde (OPA) in the presence of 2-mercaptoethanol (method 1) or in presence of ethanethiol (method 2) with eventual elimination of the excess of other amino acids (method 3). Using method 1 the DAPA isomers can be determined. It could be concluded that the methods 1 and 2 are satisfactory sensitive and selective for DAPA determination in bacterial material using UV detection while the determination of low DAPA concentration in digestive tract content needs the fluorescence detection.