The use of reverse transcription and polymerase chain reaction [RT-PCR] for the detection of hop latent viroid [HLVd]

The simple method of nucleic acids extraction, based on guanidine thiocyanate extraction buffer, was sufficient for obtaining a good templates for RT-PCR. The RT-PCR reactions were performer from the start to the end (both the reverse transcription and the HLVd-cDNA amplification) in the same reaction mixture and in the very small volume of reaction (10 μI). Both pairs of primers designed by authors were good for reverse transcription and later for amplification of the HLVd-cDNA. The presence of gelatin as a stabilizer of DNA polymerase was indispensable for successful performance of RT-PCR.

Wiroidy, najmniejsze obecnie znane patogeny roślin, zbudowane z pojedynczej nici kolistego RNA, nie zawierające w swej budowie i nie kodujące żadnych białek, są groźnymi patogenami roślin wyższych, rozpowszechnionymi we wszystkich rejonach świata, szczególnie w uprawach roślin rozmnażanych wegetatywnie. Wiroid latentny chmielu (ang. hop latent viroid - HLVd) został wykryty dopiero w 1988 roku w chmielu. Do tej pory odnotowano go w rejonach uprawy chmielu na całym świecie. Chmiel, jedyny znany żywiciel tego patogena, ulega tylko infekcjom utajonym (latentnym). HLVd powoduje zarówno spadek masy plonu szyszek jak i zawartości alfa-kwasów w szyszkach. Bezobjawowe infekcje oraz brak białek strukturalnych i innych produktów translacji powodują, że obecnie patogena tego można wykrywać tylko przy pomocy elektroforezy (metoda bardzo zawodna, wymagająca wysokiego stężenia RNA patogena w tkance), sond hybrydyzacyjnych i rozwijanej w ostatnich latach metody RT-PCR. Podczas opracowywania RT-PCR do wykrywania HLVd w ekstraktach kwasów nukleinowych wykorzystywano dwie pary primerów specyficznych dla sekwencji nukleotydowej HLVd, charakteryzujących się różnymi temperaturami topnienia produktu. Wiroida wykrywano w ekstraktach kwasów nukleinowych z blaszek liściowych i z ogonków liściowych chmielu. Uproszczona metoda guanidynowa do izolacji totalnych kwasów nukleinowych okazała się wystarczająca do przeprowadzenia reakcji RT-PCR. Opracowana metoda charakteryzowała się bardzo dużą czułością, specyficznością (produkty amplifikacji cDNA-HLVd uzyskiwano tylko z próbek materiału roślinnego pochodzącego z roślin zawierających tego wiroida) i szybkością wykonania (dwa dni łącznie z ekstrakcją kwasów nukleinowych). Ponadto w zastosowanej metodzie opracowano warunki do przeprowadzenia zarówno odwrotnej transkrypcji i następnie amplifikacji powstałego cDNA wiroida w jednej probówce, w tej samej mieszaninie reakcyjnej . Oprócz tego wszystkie reakcje RT-PCR prowadzono w bardzo małej objętości równej 10 μl (2 μl zawiesiny kwasów nukleinowych i 8 μl mieszaniny reakcji RT-PCR). Maksymalne uproszczenie metody, wielokrotne obniżenie kosztów reakcji oraz charakterystyczna dla RT-PCR czułość, specyficzność i szybkość przeprowadzenia testu sprawiają, że może być ona wykorzystywana do rutynowego wykrywania nie tylko HLVd ale również innych wiroidów, wirusoidów i wirusów RNA.