Immunohistochemiczna metoda identyfikacji komórek CD133+ w glioblastoma

Glioblastoma (GBM, WHO grade IV) is the most lethal type of brain tumours. Despite advances in radiotherapy, chemotherapy and surgical techniques, this tumour is still associated with a median overall survival of approximately 1 year. Histopathological features of GBM include nuclear atypia, foci of palisading necrosis, microvascular proliferation and robust mitotic activity. Glioblastoma is one of the best vascularized tumours in humans and its proliferation is hallmarked by a distinct proliferative vascular component. Studies of glioblastoma’s vascularization have cast some light on the role of non-endothelial cells in tumour neoangiogenesis. A characteristic feature of protein CD133 is its rapid down-regulation during cell differentiation, which makes it a unique cell surface marker for identification of stem cells in brain tissue. CD133+ tumour cells are located mainly in perivascular niches. CD133 positive cells were also found in blood vessels wall. The aim of this study was to optimize immunohistochemical staining method to facilitate identification of cells recognized by anti-CD133 antibody in paraffin-embedded glioblastoma tissue sections. In this study, several pretreatments, detection systems, dilution of antibody and time incubation were used. Immunohistochemical staining method in which autoclave, a buffer pH 9.0 and LSAB+System-HRP were used gave the best result.

Najczęstszym i jednocześnie najgorzej rokującym nowotworem pochodzenia astrocytarnego jest glioblastoma (IV stopień złośliwości według Światowej Organizacji Zdrowia). Obraz mikroskopowy glioblastoma charakteryzuje się atypią komórkową, obecnością ognisk martwicy palisadowej oraz proliferacją drobnych naczyń. Wyróżniamy dwa typy glioblastoma: pierwotny i wtórny. Jedną z podstawowych cech histopatologicznych tego nowotworu jest obecność proliferacji naczyniowych. Proliferacje naczyń glioblastoma rozpoznawane są jako wielowarstwowe kłębki rozrośniętych i mitotycznie aktywnych komórek endotelialnych. Komórki macierzyste odgrywają znaczącą rolę w tworzeniu sieci naczyń krwionośnych nowotworu za sprawą różnicowania w kierunku komórek endotelialnych. Za marker nowotworowych komórek macierzystych uważa się antygen CD133. Komórki nowotworu wykazujące ekspresję tego białka rozpoznawanego przez odpowiednie przeciwciała zlokalizowane są w niszach otaczających naczynia krwionośne występujące w masie nowotworu. Komórki CD133+ występują również w ścianach naczyń krwionośnych. Celem przeprowadzonych badań było opracowanie optymalnej immunohistochemicznej metody barwienia, z wykorzystaniem przeciwciała przeciw CD133, która ułatwi identyfikację komórek macierzystych. Materiał do badań stanowiły preparaty histopatologiczne pobrane do rutynowych badań histopatologicznych w czasie zabiegu operacyjnego z wcześniej rozpoznanymi przypadkami glioblastoma. Badania obejmowały różne metody barwień immunohistochemicznych z wykorzystaniem zróżnicowanych sposobów odmaskowywania antygenów, z zastosowaniem odmiennych buforów, systemów detekcyjnych oraz rozcieńczeń przeciwciała i czasów inkubacji preparatów z przeciwciałem. Najlepsze wyniki barwienia immunohistochemicznego otrzymano w preparatach, w których w celu odmaskowywania antygenu zastosowano autoklaw, bufor o pH 9,0 i system detekcyjny LSAB+System-HRP.