Elektroforetyczna identyfikacja proteinaz cysteinowych w surowicach pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (PBL) z wykorzystaniem biotynylowanego jodoacetamidu

Wstęp: Proteinazy cysteinowe są enzymami regulującymi liczne procesy fizjologiczne oraz patologiczne w organizmie człowieka. Zaburzenie ich aktywności może przyczyniać się do wystąpienia wielu chorób. Pełnią one ważną rolę w procesie kancerogenezy, uczestnicząc w inwazji, transformacji nowotworowej, angiogenezie, apoptozie oraz powstawaniu przerzutów. Celem pracy było opracowanie elektroforetycznej metody identyfikacji proteinaz cysteinowych w surowicach pacjentów z przewlekłą białaczką w oparciu o jodoacetamid biotynylowany. Materiał i metody: Badania wstępne przeprowadzono na handlowym preparacie papainy (EC 3.4.22.2), dobrze poznanej i szeroko stosowanej roślinnej proteinazy cysteinowej o masie cząsteczkowej 23,4 kDa. Badania wykonano na próbach surowicy uzyskanych z pełnej krwi pobranej od pacjentów chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową (PBL) oraz surowicach kontrolnych uzyskanych od dawców. Surowice po wstępnej inkubacji z jodoacetamidem mieszano z buforem do prób i poddawano rozdziałowi elektroforetycznemu w żelu poliakrylamidowym zawierającym dodecylosiarczan sodu (SDS–PAGE). Rozdzielone elektroforetycznie białka po transferze na nitrocelulozową membranę, poddawano dalszej analizie za pomocą streptawidyny skoniugowanej z peroksydazą chrzanową (HRP). Użycie substratu dla HRP, czterochlorowodorku 3,3’–diaminobenzydynyny (DAB), umożliwiało identyfikację biotynylowanego jodoacetamidu, a przez to związanych z nim w sposób nieodwracalny proteinaz cysteinowych obecnych w badanych surowicach. Wyniki: Analiza porównawcza surowic pobranych od pacjentów chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową w odniesieniu do surowic kontrolnych pozwoliła na identyfikację dodatkowego białka o charakterze proteinazy cysteinowej o masie cząsteczkowej wynoszącej około 37 kDa, które nie występowało lub było obecne w niewielkiej ilości w surowicach kontrolnych. Wnioski: Opracowana metoda umożliwia wykrywanie proteinaz cysteinowych w surowicach kontrolnych, jak i u pacjentów chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową.

Introduction: Cysteine proteases are enzymes that regulate numerous physiological and pathological processes in the human body. Disorders of their activity can lead to a number of diseases. They play an important role in the process of carcinogenesis, participating in the invasion, transformation, angiogenesis, apoptosis and metastasis. The aim of this study was to elaborate the electrophoretic method of cysteine proteinases identification in the sera of patients suffering from chronic lymphocytic leukemia based on biotinylated iodoacetamide. Material and methods: Preliminary studies were carried out on the commercially available papain (EC 3.4.22.2) well known and widely used plant cysteine protease with a molecular weight 23,4 kDa. The study was conducted on the blood samples taken from patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and control sera from healthy donors. The sera after the preincubation with iodoacetamide were mixed with the sample buffer followed by electrophoresis on polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS–PAGE). The separated proteins were electrophoretically transferred to the nitrocellulose membranes and subjected to the further analysis using streptavidin conjugated with horseradish peroxidase (HRP). The use of substrate for HRP 3,3’- diaminobenzidine tetrachloride (DAB) allows the biotinylated iodoacetamide and thereby cysteine proteinase identification. Results: The comparative analysis of the sera from the patients with chronic lymphocytic leukemia and the control sera led to the identification of additional protein with a cysteine protease characteristic having a molecular weight of about 37 kDa, which did not occur or was present in a smaller amount of the control sera. Conclusions: The developed method allows the detection of cysteine proteases which are present in the control sera and the sera of patients with chronic lymphocytic leukemia.