Detekcja enzymów z wykorzystaniem macierzy polimer-substrat

Ocena aktywności enzymów jest kluczowym zagadnieniem w badaniu kinetyki reakcji enzymatycznych i inhibicji. Ostatnio, macierze polimerowo-peptydowe, gdzie peptyd jest specyficznym substratem dla enzymu wzbudzają coraz większe zainteresowanie wśród biochemików. W połączeniu z czułymi metodami detekcji takimi jak spektrometria mas i fluorescencja macierze mogą znaleźć zastosowanie jako niezwykle użyteczne narzędzia do detekcji enzymów i oceny ich aktywności w diagnostyce klinicznej. Macierze peptydowe składają się z powierzchni, na której immobilizowane są peptydy . Peptydy mogą być przyłączone bezpośrednio do sfunkcjonalizowanej powierzchni lub poprzez polimerowy linker. Obecność polimerowego linkera pomiędzy powierzchnią a peptydem przynosi wiele korzyści. Zastosowanie linkera z poli(tlenku etylenu) minimalizuje niespecyficzną adsorpcję biomolekuł na podłożu, zapewnia niskie tło w pomiarach fluorescencyjnych i ułatwia dostęp steryczny centrum aktywnego do peptydu. W niniejszej pracy koniugaty peptydów z poli(tlenkiem etylenu) zostały otrzymane na drodze syntezy na nośniku stałym metodą Fmoc. Otrzymane koniugaty immobilizowano na powierzchni krzemu zmodyfikowanej aminopropy lotrietoksy silanem. Powierzchnię scharakteryzowano techniką AFM i zbadano jej kąt zwilżania. Tak otrzymane macierze peptydowe poddano inkubacji z enzymami a produkty reakcji analizowano za pomocą techniki ESI MS.

Enzyme assays are methods for measuring enzymatic activity, they are vital to study enzyme kinetics and enzyme inhibitors. Recently, polymer-peptide arrays where the peptide is specific substrate for the enzyme have attracted high attention. Such arrays can be applied as invaluable tools for enzyme recognition when connected to fluorescence or mass spectrometry detection. Peptide arrays consist of peptides immobilized on solid support directly or through polymeric linker. It w as shown that the presence of poly(ethylene oxide) as a linker between surface and the peptide offers many advantages. It minimizes non-specific binding of biomolecules on the surface, provides low background in fluorescence measurement, avoids steric hindrance , and thus makes linked peptide fully accessible the active site of an enzyme. In this work, conjugate of peptide and poly(ethylene oxide) were synthesized on the Tentagel resin using solid phase Fmoc chemistry, and then covalently immobilized by grafting-to method on the silica surface. Silica plates before grafting were modified by 3-aminopropy ltriethoxy silane and characterized by AFM and contact angel measurement. The obtained peptide arrays were incubated with enzymes and products of these reactions were analyzed by ESI MS.